Статья подтверждающая эффективность гриба Чага против ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 2 ТИПА

МЕЛАНИНЫ ИЗ ГЛУБИННОЙ КУЛЬТУРЫ INONOTUS OBLIQUUS И ИХ ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 2 ТИПА.

Ананько Г.Г., Теплякова Т.В., Бардашева А.В.Ильичева Т.Н.

ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово, Новосибирская область.

Гриб чага Inonotus obliquus издавна используется в народной медицине. В России с 50-х гг. прошлого века выпускается препарат Бефунгин, основой которого являются водорастворимые хромогены, меланины. Ранее было показано, что меланины из природного сырья чаги обладают противовирусной активностью [1]. Из-за интенсивных заготовок запасы природной чаги быстро уменьшаются, поэтому становятся актуальными биотехнологические способы получения меланинов в глубинной культуре. Цель работы – сравнительное исследование эффективности различных режимов глубинного культивирования чаги и возможности использования полученных меланинов в качестве антивирусного средства в отношении вируса простого герпеса 2 типа. Материалы и методы. Штамм I. obliquus F-1244 был выделен в культуру из склероциев чаги, собранных в республике Тыва. Для получения меланинов в глубинной культуре использовали глюкозо-триптонную среду (ГТС) следующего состава, г/л: глюкоза – 30; триптон – 2,5; дрожжевой экстракт – 1,25; KH2PO4 – 1,1; K2HPO4 – 4,4; г/л MgSO4 – 0,25; рН 7,0 – 8,0. Культивирование осуществляется в 0,75 л колбах на качалке при 200 об/мин, 26 °С в течение 12–15 сут до максимального накопления меланинов. Для выделения меланинов культуральную жидкость (КЖ) отделяли от мицелия посредством фильтрования глубинной культуры на бумажном фильтре; меланины осаждали путем закисления среды соляной кислотой до рН < 2,0. Меланины из мицелия экстрагировали 2%-ным раствором NaOH (1:10), прогревая на водяной бане в течение 2 ч при 100 °С. Экстракты меланинов объединили и провели очистку от примесей посредством 3-кратного переосаждения. Для исследования противовирусной активности использована культура клеток Vero. Клетки выращивали на среде МЕМ (Gibco) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки плодов коров (Gibco), 100 Ед/мл бензилпенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/ мл канамицина в атмосфере с 5%-содержанием СО2. Клетки Vero Том 14. Глава 9. Лекарства из грибов 385 рассевали на 96-луночные планшеты в количестве 20 000 кл/лунку. Приготовленные разведения препаратов наносили на двухсуточную культуру (по 3 повтора на каждое разведение). Для определения противовирусной активности в лунки добавляли вирус в дозе 100 БОЕ/мл. Учет реакции проводили на 4-е сут. Оценка противовирусной активности образцов и их токсичности для культуры клеток Vero: оценка активности образцов была проведена при помощи анализа редукции бляшек. Клетки окрашивали генциан-виолетом. Результаты теста регистрировали с помощью фотометра 680 Земфира с управляющим компьютером BioRed RU Zemf в соответствии с инструкцией производителя. Получены показатели оптической плотности (ОП570) для каждой из лунок планшета. Обработку данных проводили с помощью Microsoft Office Excel 2003. В таблицах приведены средние статистически достоверные данные при 95%-й вероятности. Результаты и обсуждение. Протестировано 4 фактора, которые потенциально могли бы повлиять на продукцию меланина культурой I. obliquus F-1244. Так, ранее было показано [2], что облучение чашек с инокулюмом I. оbliquus синим светом в последующем стимулировало рост глубинной культуры и синтеза меланина. Мы использовали иную схему, постоянное облучение синим светом растущей глубинной культуры чаги, которое оказало негативное влияние на продукцию меланина – выход меланинов снизился в 1,8 раза, в сравнении с контролем (табл. 1; см. след. стр.). Вероятно, влияние облучения носит сложный характер и его эффект существенным образом зависит от интенсивности и стадии роста культуры. Второй исследованный фактор, добавка перекиси водорода в культуру, оказал временный позитивный эффект на продукцию меланинов, но конечный выход меланинов существенно не отличался от контроля. Результаты говорят о том, что добавка перекиси может ускорить процесс получения меланинов и эти выводы согласуются с ранее полученными данными [3] о стимулирующем влиянии перекиси водорода на продукции меланинов. В варианте № 4 колбы с 4-суточной культурой чаги были помещены в холодильник (4–6 °С) на трое суток и затем возвращены на качалку. В  этом варианте позитивный эффект был более заметным: конечный выход меланинов увеличился 1,3 раза. Четвертый фактор, добавка сульфата меди в питательную среду, как стимулятора меланиногенеза, описан в патенте [4]. Действительно, добавка меди оказала самый заметный эффект: синтез меланинов начался уже на  вторые сутки, когда в других вариантах меланин отсутствовал.

*Контроль – глубинная культура Inonotus obliquus F-1244 на среде ГТС (см. методы), выращенная на качалке, при 26 °С и 200 об/мин, в течение 14 суток. Другие культуры выращивали также на ГТС, как контроль, с небольшими модификациями условий, которые указаны в таблице. 

За счет более раннего начала синтеза и более высокой скорости синтеза в варианте №5 выход меланинов составил 4,7 г/л глубинной культуры, что в 5 раз больше, чем в контроле. Эффективность этой добавки обусловлена тем, что ионы меди являются коферментами лакказы, участвующей в синтезе предшественников меланина [5]. Таким образом, наиболее эффективным стимулятором синтеза меланинов в глубинной культуре штамма I. obliquus F-1244 является добавка ионов меди. Добавка ионов меди в питательную среду индуцирует процесс синтеза меланинов в культуре I. obliquus F-1244, что позволяет существенно (в ~ 5 раз) увеличить выход меланинов. Поэтому представляло интерес сравнительное исследование антивирусной активности меланинов, полученных на среде ГТС и среде ГТС с добавкой сульфата меди (табл. 2). Том 14. Глава 9. Лекарства из грибов

Таблица 2. Токсичность и противовирусная активность образцов из глубинной культуры Inonotus obliquus F-1244 (ВПГ-2)

Примечания: – TC50 – токсическая концентрация образцов, при которой погибает 50 % неинфицированных клеток MDCK; – IC50 – концентрация сухих веществ в образцах, подавляющая развитие 50 % вируса гриппа; – IS – индекс селективности, определяется как отношение TC50/ IC50. Оказалось, что меланины, полученные в присутствии ионов меди, существенно менее активны (более чем на порядок) в отношении вируса простого герпеса 2-го типа. В синтезе меланинов участвует комплекс ферментов, в частности, лакказа, коферментом которой являются ионы меди. Очевидно, конечная структура синтезируемых молекул меланинов зависит от соотношения активностей всех ферментов, участвующих в синтезе полимера. Можно предположить, что добавка меди, стимулируя работу лакказы, смещает точку динамического равновесия в работе ферментативного комплекса, что приводит к определенным изменениям конечной структуры меланинов. Таким образом, наблюдаемое снижение активности № п/п Подготовка экстракта TC50 (мкг/мл) IC50 (мкг/мл) IS 1. Культуральная жидкость (без мицелия), среда ГТС >4720 9,2±1,3 >513 2. Культуральная жидкость (без мицелия), среда ГТС + 0,08 г/л CuSO4 2000±400 75±15 27 3. Очищенный меланин, выделенный из культуры F-1244, выращенной на среде ГТС 4300±600 <4,9 >878 4. Очищенный меланин, выделенный из культуры F-1244, выращенной на среде ГТС с добавкой CuSO4 (0,08 г/л) >2280 60±9 >38 388 Успехи медицинской микологии. 2015 меланинов, по-видимому, является результатом модификации их структуры, обусловленной, в свою очередь, гиперстимуляцией фермента лакказы ионами меди. Проведенное исследование демонстрирует сложность задач, стоящих перед биотехнологами на пути создания промышленной технологии производства меланинов. Казалось бы, безусловный успех, увеличение выхода меланинов в ~5 раз за счет добавки меди, тем не менее полностью нивелируется снижением его противовирусной активности из-за сопутствующей модификации продукта. В то же время, выявленный эффект может послужить основой для будущей работы, направленной на исследование молекулярных механизмов антивирусной активности меланинов.

Список литературы 1. Патент №2480227 Российская Федерация, МПК C12N1/14 A61K36/06, Противовирусное средство на основе меланина. ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (RU). №2011127305/15, заявл. 01.07.2011; опубл. 27.04.2013 Бюл. № 12: 11 с. 2. Поединок Н.Л. Световая регуляция роста и меланинообразования у Inonotus оbliquus (Pers.) Pilat Biotechnologia Acta 2013; 6(2): 115-20. 3. Zheng W, Zhao Y, Zhang M et al. Oxidative stress response of Inonotus obliquus induced by hydrogen peroxide. Med Mycol. 2009; 47(8): 814- 23. 4. Патент РБ. BY 10670 C1 2008.0630. Штамм гриба Inonotus obliquus БИМ F-350 Д – продуцент меланина, обладающий антимутагенными свойствами. 5. Thurston CF. The structure and function of fungal laccases. Microbiology. 1994; 140(1): 19-26.